Методи як інструменти вивчення бактерій
Зміст
- Загальні положення Вивчення морфології і рухливості Дослідження ферментативної активності і метаболізму Дослідження чутливості до антибіотиків Дослідження генетики бактерій
Для обивателя, не утаємниченого в таїнства мікробіологічних досліджень, весь процес вивчення мікробів представляється складним, специфічним і вимогливим до якості і кількості спеціального обладнання. Таке уявлення відповідає дійсності лише частково, оскільки вся складність і специфічність побудована на певній мікробіологічної абетці. Ця азбука складається з опису методів вивчення бактерій та інших мікроорганізмів, а також з порядку побудови висновків за результатами проведених досліджень.
Виявлення патогенних мікроорганізмів у лабораторних умовах
Загальні положення
До загальних положень при вивченні методів дослідження мікробів можна віднести порядок вибору того інструменту, яким будуть проводитися лабораторні аналізи бактеріальної клітини, і послідовність інтерпретації тих висновків, на підставі яких будуть фіксуватися остаточні висновки по досліджуваному мікроорганізму.
Вибір методу вивчення в першу чергу залежить від предмета досліджень:
Якщо планується вивчити будову і морфологію клітини, її ультраструктуру (складові структури і компоненти) і встановити наявність рухливості, використовується два види мікроскопії: мікроскопія бактеріальних клітин у живому стані і в пофарбованому вигляді.
Вивчення метаболізму і ферментативної активності мікроорганізмів проводиться шляхом посіву вирощених колоній на диференційно-діагностичні живильні середовища.
Визначення чутливості до антибіотиків проводиться методом дифузії в агар.
Вивчення генетики мікроорганізмів (їх спадковості і мінливості) здійснюється шляхом проведення перераспределительного тесту, методом реплік і ряду інших спеціалізованих досліджень.
Кожен із зазначених методів має свої варіації виконання, які залежать від особливостей умови проведення аналізу і від досліджуваного матеріалу.
Виявлення патогенних мікробів в лабораторних условіяхКроме того, є маса вузькоспеціальних мікробіологічних експериментів, які дозволяють визначити ті чи інші особливості структури або властивостей бактеріальної клітини.
Вивчення морфології і рухливості
Морфологічне дослідження в основному спрямоване на ідентифікацію бактерій.
Вивчення форм і виявлення рухливості проводиться методом микроскопирования живих бактерій.
Основні структури мікроорганізму аналізуються в препаратах роздавленою або висячої краплі. Це спосіб нанесення бульйонного розчину з бактеріальною культурою на предметне скло.
Цей метод визначення будови бактерії може проводитися шляхом спостережень в “темному полі зору”.
Принцип експерименту полягає в тому, що дослідником створюються такі умови, коли мікробні тіла не висвітлюються напряму, а відбивають промені світла, що дозволяє розглянути їх основні структури більш докладно і в нативної (природної) середовищі.
мікроскопічний методАналіз з використанням різних способів фарбування припускає, що фарбуватися будуть убиті мікробні клітини, оскільки вони краще фарбуються.
Для проведення аналізу необхідно здійснити кілька маніпуляцій:
Приготувати мазок досліджуваного матеріалу. У цю стадію входить робота з досліджуваним матеріалом (кров, харкотиння і т. д.).
Висушування і фіксація мазка хімічним або фізичним способом.
Вибір виду фарбування (складний або простий).
Простим способом бактеріальні клітини фарбують у більшості випадків тільки для того, щоб виявити в досліджуваному матеріалі присутність мікроорганізмів. Цей спосіб являє собою забарвлення мазка метиленовим синім. Даний барвник забарвлює фон мазка на порядок слабше, ніж клітини самих мікроорганізмів.
Виявлення основних структур бактеріальної клітини здійснюється з використанням складного фарбування:
Метод Грама (визначення властивостей клітинної стінки);
забарвлення на виявлення спор;
забарвлення за Романовським-Гімзою забарвлює в різні кольори основні структури клітини;
виявлення капсул за способом Гінса;
виявлення зерен волютину (внутріплазматіческіе гранули, що складаються з неорганічних поліфосфатів), їх присутність вказує на наявність збудника діфтеріі. Ізученіе мікробів в лабораторії
Дослідження ферментативної активності і метаболізму
Дослідження ферментативної активності і метаболізму бактеріальних клітин починається з підбору поживних середовищ, на яких досліджувані мікроорганізми зможуть проявити потрібні досліднику властивості.
Для приготування поживних середовищ використовуються:
Продукти тваринного походження;
продукти рослинного походження;
органічні і неорганічні сполуки визначеного хімічного складу.
За своїм складом поживна середу повинна бути:
З підходящим для конкретного виду мікроорганізмів рівнем рН (кислотністю);
з достатнім рівнем вологості, оскільки для бактерій важливо стан осмотичного тиску зовнішнього середовища;
Ізотонічність і стерильною.
Після створення живильного середовища здійснюється посів на неї біологічного матеріалу та виділення чистої культури.
Після виділення та ідентифікації чистої культури вивчаються її біохімічні властивості і ферментативна активність.
Етапи виділення чистої культуриДля визначення ферментативної активності бактеріальної клітини виділену культуру засівають на диференційно-діагностичні живильні середовища, які заздалегідь створені під виявлення того чи іншого ферменту.
Для виявлення сахаролитической біохімічної активності клітини досліджуваної культури засівають в п’ять пробірок, в які закладають різні органічні цукру. Залежно від того, в якій з пробірок буде виявлена біохімічна активність (спрацює колірний індикатор), визначається, якими сахаролитической властивостями володіє досліджувана бактеріальна клітина.
Для визначення протеолітичної активності чисту бактеріальну культуру засівають на мясопептонний желатин. Там, де під дією протеолітичного ферменту відбувається розщеплення білків желатину (розрідження), там і фіксується присутність протеолітичного ферменту. Для визначення глибини роботи протеолітичних ферментів при даних аналізах проводять дослідження на виявлення індолу і сірководню (кінцевих продуктів протеолітичного розпаду).
Встановлення редуцирующей здатності бактерій виробляється з засіванням лакмусового молока. Присутність редуктази проявляється специфічним знебарвленням молока.
Виявлення каталази відбувається шляхом фіксації на щільному живильному середовищі в чашці Петрі появи пухирців газу, який виділяється в результаті розщеплення перекису водню під дією каталази.
Дані дослідження дозволяють визначити основні властивості тих чи інших мікробів. Так, присутність протеолітичного або сахаролитической ферменту – свідчення наявності патогенних для людини, тварин і рослин властивостей досліджуваного мікроорганізму.
Дослідження чутливості до антибіотиків
визначення чутливості бактерій до антібіотікамІсследованіе чутливості мікроорганізмів до антибіотиків здійснюється за принципом поділу бактерій на чутливих і стійких до дії антибіотиків.
Вивчення цього властивості особливо важливо для практичної медицини, де постійно необхідно досліджувати інфікований матеріал і підбирати антибіотики для лікування.
Зважаючи на те що мікроби вміють швидко пристосовуватися до того руйнівній дії, яке на них чинять антибіотики, дуже важливо на початкових стадіях лікування визначити, як буде впливати запланований до лікування антибіотик і чи присутній у досліджуваного біологічного матеріалу чутливість до планованого способу антибактеріального впливу.
Для початку за допомогою досліджень патогенного матеріалу визначають, який мікроб провідний в осередку зараження (визначення ведеться, в тому числі, і методом кількісного підрахунку).
Якщо встановлений провідний мікроорганізм, то його чутливість визначається шляхом дифузії в агар із застосуванням паперових дисків. Спеціально розроблені і випускаються паперові диски заздалегідь оброблені антибіотиками в потрібній концентрації. Чутливість до певного антибіотику на паперовому диску визначається за вповільненого росту колонії на відповідних зонах диска і по різному фарбуванню дисків.
дослідження бактерійКроме методу з використанням паперових дисків, також для визначення чутливості бактерій до антибіотиків застосовується спосіб стерильних розведень. Бульйонні культури мікробів вносять в розведені розчини антибіотиків. У процесі вивчення мікробів на чутливість до антибіотиків пробірки інкубують і витримують певну кількість часу.
Результати дослідження вивчають по таблиці чутливості, де вказані вихідні і кінцеві дані концентрації антибіотиків і біологічного матеріалу.
Дослідження генетики бактерій
Генетика дозволяє визначити властивості спадковості і мінливості конкретного мікроорганізму. Вивчення цих властивостей дуже важливо, оскільки дає можливість зрозуміти механізм тих мутацій в генному коді, які дозволяють бактеріям з такою неймовірною швидкістю і легкістю пристосовуватися до мінливих зовнішніх умов.
Ще однією важливою особливістю генетики бактерій є те, що її принципи справедливі для всього органічного світу. Вивчивши генетику бактерій, можна на молекулярному рівні встановити всі основні еволюційні закони.
Основний предмет вивчення генетики бактерій – мутації (стрибкоподібне зміна спадкового ознаки).
Чашка ПетріІсследованіе мутацій відбувається з використанням бактеріофагів (віруси бактерій, які руйнують бактеріальну клітину).
Вироблювана бактеріями в результаті мутацій стійкість до фагів фіксується різними методами:
Флуктуаційний тест;
перерозподільчий тест;
метод реплік і т. д.
Зміна в генетиці досліджуваної бактерії фіксується тільки тоді, коли придбаної однієї колонією властивість передається у спадок наступним поколінням.
Мутантів серед бактерій виявляють наступними методами:
Прямий відбір (посів на спеціально підібрану селективну середу);
непряме виявлення, так званий метод передруку колоній з однієї чашки Петрі на іншу до виявлення прогнозованих мутантів;
пеніциліновий метод дозволяє досить швидко виявити мутантів, оскільки вводиться дослідником пеніцилін пригнічує ріст немутіровавшіх клітин.
Аналіз на бактерііІсследованіе генетики бактерій виробляється з використанням новітнього обладнання, яке дозволяє не тільки виявити зміни спадковості, але й на молекулярному рівні визначити їх природу.
Сьогодні такі дослідження генетики бактерій знаходяться в активній фазі. Мікробіологи регулярно діляться зафіксованими новинками. Про завершення досліджень у цій області говорити поки ще дуже рано.
(2 votes, average: 4.00 out of 5)