Внутрішньовидова ідентифікація бактерій
Рестрикційний аналіз заснований на застосуванні ферментів, що носять назву рестриктаз. Рестріктази являють собою ендонуклеази, які розщеплюють молекули ДНК, розриваючи фосфатні зв’язки не в довільних місцях, а в певних послідовностях нуклеотидів. Особливе значення для методів молекулярної генетики мають рестріктази, які дізнаються послідовності, що володіють центральної симетрією і зчитувати однаково в обидві сторони від осі симетрії. Точка розриву ДНК може або збігатися з віссю симетрії, або бути зрушена щодо неї.
В даний час з різних бактерій виділено та очищено понад 175 різних рестриктаз, для яких відомі сайти (ділянки) впізнавання (рестрикції). Виявлено понад 80 різних типів сайтів, в яких може відбуватися розрив подвійної спіралі ДНК. У геномі конкретної таксономической одиниці знаходиться строго певний (генетично задетермінірованное) число ділянок впізнавання для певної рестріктази. Якщо виділену з конкретного мікроба ДНК обробити певної рестриктазой, то це призведе до утворення строго певної кількості фрагментів ДНК фіксованого розміру. Розмір кожного типу фрагментів можна дізнатися за допомогою електрофорезу в агарозному гелі: дрібні фрагменти переміщаються в гелі швидше, ніж більші фрагменти, і довжина їх пробігу більше. Гель забарвлюють бромистим етидієм і фотографують в УФ-випромінюванні. Таким способом можна отримати рестрикційну карту певного виду мікробів.
Зіставляючи карти рестрикції ДНК, виділених з різних штамів, можна визначити їх генетичну спорідненість, виявити приналежність до певного виду чи роду, а також виявити ділянки, піддані мутацій. Цей метод використовується також як початковий етап методу визначення послідовності нуклеотидних пар (секвенування) і методу молекулярної гібридизації.
Визначення плазмідної профілю бактерій. Плазмідний профіль дозволяє провести внутрішньовидову ідентифікацію бактерій. Для цього з бактеріальної клітини виділяють плазмидную ДНК, яку поділяють електрофорезом в агарозному гелі для визначення кількості та розмірів плазмид.
Ріботіпірованіе. Послідовність нуклеотидних основ у опероном, що кодують рРНК, характеризується наявністю як консервативних ділянок, які зазнали малих змін в процесі еволюції і мають подібне будови у різних бактерій, так і варіабельних послідовностей, які родо – і відо-специфічні і є маркерами при генетичної ідентифікації. Ці Оперон представлені на бактеріальної хромосомі в кількох копіях. Фрагменти ДНК, отримані після обробки її рестриктазами, містять послідовності генів рРНК, які можуть бути виявлені методом молекулярної гібридизації з міченої рРНК відповідного виду бактерій. Кількість і локалізація копій оперонов рРНК і рестрикційний складу сайтів як всередині рРНК-оперона, так і за його флангах варіюють у різних видів бактерій. На основі цієї властивості побудований метод ріботіпірованія, який дозволяє проводити моніторинг виділених штамів і визначення їх виду. В даний час ріботіпірованіе проводиться в автоматичному режимі в спеціальних приладах.
(1 votes, average: 5.00 out of 5)