Ферментний імуносорбентний аналіз

Існує цілий ряд підходів, що дозволяють визначити, чи відбулася зв’язка антитіла з антигеном-мішенню. Один з них – це ферментний іммуносорбентний аналіз (ELISA), який часто використовують для діагностики. Процедура включає наступні етапи.

1. Зразок, в якому хочуть виявити специфічну молекулу або мікроорганізм, фіксують на твердій підкладці, наприклад на пластиковій мікротитрувального плашці зазвичай має 96 лунок.

2. До фіксованому зразком додають антитіло, специфічне до маркерною молекулі (перше антитіло), потім промивають лунку, щоб видалити Незв’язана молекули першого антитіла.

3. Додають друге антитіло, яке специфічно зв’язується з першим антитілом і не взаємодіє з маркерною молекулою. До цього антитілу приєднаний фермент (наприклад, лужна фосфатаза, пероксидаза або уреаза), що каталізує перетворення незабарвленого субстрату в забарвлений продукт. Промивають лунку, щоб видалити Незв’язана молекули кон’югата друге антитіло-фермент.

4. Додають незабарвлений субстрат.

5. Проводять якісне або кількісне визначення забарвленого продукту.

Якщо перше антитіло не зв’язується з мішенню зразка, то воно віддаляється при першому промиванні. Оскільки при цьому кон’югату друге антитіло-фермент не з чим зв’язуватися, він видаляється при другому промиванні, і зразок залишається незабарвленим. Якщо зв’язування з мішенню відбувається, то друге антитіло приєднується до першого, і кон’югований фермент каталізує утворення легко реєстрованого забарвленого продукту.

Основний принцип ELISA – специфічне зв’язування першого антитіла з мішенню. Якщо молекула-мішень являє собою білок, то його очищений препарат зазвичай використовують для отримання антитіл, за допомогою яких потім і виявляють дану мішень. Антитіла, які утворюються в сироватці (антисироватки) крові імунізованих тварини (зазвичай кролика), зв’язуються з різними антигенними детермінантами (епітопами) молекули-мішені. Таку суміш антитіл називають поліклональним препаратом. Використання поліклональних антитіл має два недоліки, істотних для деяких методів діагностики: 1) зміст окремих антитіл в Поліклональні препараті може варіювати від однієї партії до іншої; 2) поліклональні антитіла не можна застосовувати, якщо необхідно розрізнити дві подібні мішені, т. Е. Коли патогенна (мішень) та непатогенна (Не-мішень) форми розрізняються єдиною детермінантою. Однак ці проблеми цілком вирішувані, оскільки зараз навчилися отримувати препарати антитіл, вироблених до однієї антигенної детермінанті, т. Е. Препарати моноклональних антитіл.


1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars (2 votes, average: 5.00 out of 5)

Ферментний імуносорбентний аналіз