Моноклональні антитіла, іммуноаналіз

Моноклональні антитіла

Моноклональні антитіла (МАТ) секретируются імунними клітинами, які походять від єдиної антітелообразующіх клітини. Тому МАТ спрямовані тільки проти певного епітопів імуногенною речовини, так званої “антигенної детермінанти”. Для отримання МАТ ізолюють лімфоцити з селезінки імунізованих миші (1) і виробляють їх злиття з пухлинними клітинами миші (клітинами мієломи) (2). Це необхідно, тому що життєздатність антителопродуцирующих лімфоцитів у культурі обмежена лише кількома тижнями. При злитті з пухлинної кліткою виникають гібридні клітини, так звані гібридоми, які є потенційно безсмертними.

Злиття клітин (2) є рідкісною подією, частота якого підвищується у присутності поліетиленгліколю [ПЕГ (PEG)]. Відбір продуктивних гібридних клітин проводиться при тривалій інкубації первинної культури в ДАТ-середовищі (НАТ-середовищі) (3), що містить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин. Аміноптерин, аналог дигідрофолієвої кислоти, конкурентно інгібує дигідрофолат-редуктазу і тим самим біосинтез дТМФ (див. С. 388). Оскільки дТМФ істотно необхідний для синтезу ДНК, мієломні клітини не можуть виживати в присутності аміноптерин. З іншого боку, клітини селезінки можуть долати дію інгібітору, використовуючи для синтезу ДНК гипоксантин і тимідин, однак і вони існують протягом обмеженого часу. Тільки Гібридома виживає у вигляді культури в середовищі ДАТ, так як ці клітини мають одночасно безсмертям мієломних клітин і здатністю клітин селезінки пристосовуватися до аміноптерин.

Насправді продукувати антитіла здатні лише поодинокі гібридомної клітини. Такі клітини необхідно виділити і розмножити клонуванням (4). Після тестування клонів на здатність утворювати антитіла відбираються позитивні культури, які знову клонуються і піддаються подальшій селекції (5). У результаті одержують гібриди, продуцирующую моноклональні антитіла. Виробництво моноклональних антитіл цими клітинами здійснюють in vitro в біореакторі або in vivo в асцитної рідини миші (6).

Б. імуноаналізу

Іммуноаналіз – це напівкількісний метод визначення вмісту речовин, присутніх в дуже низьких концентраціях. В принципі імуноаналізу можна визначати будь сполуки, що викликають утворення антитіл.

Основою цього методу є “реакція” антиген-антитіло, т. Е. Специфічне зв’язування антитіла з визначальним речовиною. З багатьох розроблених методів імуноаналізу, таких, як радіоммунний аналіз (РІА), хемілюмінесцентний іммуноаналіз і т. д., тут розглядається варіант імуноферментного аналізу (ІФА).

Зразки сироватки крові, що містять визначається речовина, наприклад гормон тироксин, поміщаються в лунки планшета для мікротітрованія (1), на стінках яких сорбованих антитіла, здатні специфічно зв’язувати гормон. Одночасно в инкубационную суміш вноситься невелика кількість тироксину, хімічно пов’язаного з ферментом, так званий кон’югат (1). Кон’югат і визначається гормон конкурують між собою за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після того як зв’язування антигенів відбулося (2), непов’язані молекули відмивають. Для визначення кількості зв’язався кон’югованого антигену в лунки вносять розчин хромогенного субстрату (субстратний буфер) і пофарбовані продукти ферментативної реакції (3) визначають фотометричним (4) (див. С. 106).

Чим більша кількість кон’югату зв’яжеться з антитілами, сорбованих на стінках лунки мікропланшетів, тим вищий вміст забарвленого продукту ферментативної реакції. У той же час, чим більше гормону в тестованої пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється за допомогою градуювальної кривої, яку будують зі стандартних зразків з відомою концентрацією, проводячи кілька паралельних вимірювань.


1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars (2 votes, average: 4.50 out of 5)

Моноклональні антитіла, іммуноаналіз