Визначення амінокислотного складу білка

Перший етап у визначенні первинної структури білків полягає в якісній і коічественной оцінці амінокислотного складу даного індивідуального білка. Необхідно пам’ятати, що для дослідження потрібно мати певну кількість чистого білка, без домішок інших білків або пептидів.

Кислотний гідроліз білка

Для визначення амінокислотного складу необхідно провести руйнування всіх пептидних зв’язків в білку. Аналізований білок гід-Роліз в 6 мовляв / л HCl при температурі близько 110 ° С протягом 24 ч. У результаті такої обробки руйнуються пептидні зв’язку в білку, а в гідролізаті присутні тільки вільні амінокислоти. Крім того, глутамін і Аспара-гін гідролізуються до глутамінової та Аспара-гіновой кислот (тобто розривається амидная зв’язок в радикалі і від них відщеплюється аминогруппа).

Поділ амінокислот за допомогою хроматографії

Суміш амінокислот, отриманих кислотним гідролізом білків, поділяють в колонці з ка-тіонообменной смолою. Така синтетична смола містить міцно пов’язані з нею негативно заряджені групи (наприклад, залишки сульфоновой кислоти-S03 ~), до яких приєднані іони Na + (рис. 1-4).

У катіонообменнік вносять суміш амінокислот у кислому середовищі (pH 3,0), де амінокислоти в основному представляють катіони, тобто несуть позитивний заряд. Позитивно заряджені амінокислоти приєднуються до негативно зарядженим частинкам смоли. Чим більше сумарний заряд амінокислоти, тим міцніша її зв’язок зі смолою. Так, амінокислоти лізин, аргінін і гістидин найбільш міцно зв’язуються з катіонообмінники, а аспарагінова і гли-тамінових кислоти-найбільш слабо.

Вивільнення амінокислот з колонки здійснюють вимиванням (елюювання) їх буферним розчином з збільшується іонною силою (тобто із збільшенням концентрації NaCl) і pH. При збільшенні pH амінокислоти втрачають протон, в результаті зменшується їх позитивний заряд, а отже і міцність зв’язку з негативно зарядженими частинками смоли.

Кожна амінокислота виходить з колонки при певному значенні pH і іонної сили. Збираючи з нижнього кінця колонки розчин (елюат) у вигляді невеликих порцій, можна отримати фракції, що містять окремі амінокислоти.

Кількісний аналіз отриманих фракцій

Кількість кожної з амінокислот в даному білку визначають, нагріваючи окремі фракції амінокислот з нінгідрином, утворюючим з’єднання червоно-фіолетового кольору. Інтенсивність забарвлення в пробі пропорційна кількості

Знаходиться в ній амінокислоти, тому по Спектрофотометричні вимірюванню світла, поглиненого Нінгідринова похідними, можна визначити зміст кожної амінокислоти в гідролізаті даного білка.

В даний час процес поділу та кількісного визначення амінокислот в гідролізаті білка повністю автоматизований і здійснюється в спеціальному приладі-аминокислотном аналізаторі.


1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars (2 votes, average: 3.50 out of 5)

Визначення амінокислотного складу білка