Секвенування ДНК
Бібліотеки генів
У генної інженерії часто потрібно виділити окремий, поки ще не охарактеризований фрагмент ДНК (DNA), наприклад, з метою визначення його повної нуклеотидної послідовності. Таке завдання вирішується шляхом створення бібліотек кДНК. Бібліотека ДНК складається з великої кількості векторних молекул ДНК, що містять різні фрагменти чужорідної ДНК. Наприклад, можливо отримати всі молекули мРНК клітини у вигляді фрагментів ДНК – кДНК (англ. Complementary DNA, cDNA) – і довільно впровадити ці копії в векторні молекули. Бібліотека генів може бути отримана шляхом розщеплення ДНК клітини на невеликі фрагменти рестриктазами (див. С. 254) і наступного вбудовування цих фрагментів у векторну ДНК. В якості векторів для отримання бібліотек ДНК використовуються бактеріофаги (скорочено: фаги). Фаги – це віруси, які інфікують бактерії, де їх геном реплікується разом з бактеріальним геномом (див. С. 390). Бібліотеки генів зручні тим, що в них легко вести пошук необхідних в даний момент фрагментів. Роботу починають з того, що невелику порцію ДНК, складову бібліотеку (105-106 фагів), розбавляють, змішуючи з клітинами бактерії-господаря, і поміщають на поживне середовище. Бактерії певний час ростуть, утворюючи на живильному середовищі щільний каламутний шар клітин. При цьому бактерії, заражені фагом, ростуть повільніше, ніж неінфіковані клітини. Це призводить до утворення прозорих кільцевих зон, “бляшок”. Клітини в “бляшці” містять потомство фагів з первісної бібліотеки. Утворилися колонії переносять на нітроцелюлозні або найлоновая фільтри, накладаючи їх на поверхню шару в чашці, і злегка підігрівають. Якщо тепер інкубувати фільтр з міченим олігонуклеотидних зондом, відповідним нуклеотидноїпослідовності цільового фрагмента, відбудеться гібридизація зонда з гомологічною послідовністю ДНК. Місце зв’язування зонда можна визначити по радіоактивної чи іншої мітці. Після цього виділяють фаг з позитивних (несучих мітку) бляшок і розмножують звичайним чином. Великі кількості необхідного фрагмента отримують за допомогою розщеплення ДНК рестриктазами.
Б. Секвенирование ДНК
Сучасним методом визначення нуклеотидної послідовності ДНК є метод обриву ланцюга (англ. Chain termination method). Насамперед фрагмент ДНК клонують в фаге М13 (див. С. 390), з якого легко виділяють однонитевую ДНК (а). Її гибрідизуючою з короткою ДНК, званої праймером, яка зв’язується з 3′-кінцем однонитевой ДНК (б). Потім до отриманої матриці додають чотири дезоксирибонуклеозидтрифосфатов дНТФ (dNTP): дАТФ (dATP), ДГТФ (dGTP), дТТФ (dTTP) і дЦТФ (dCTP). Крім дезоксирибонуклеозидтрифосфатов в реакційну суміш додають один з чотирьох дідезоксірібонуклеозідтріфосфатов [ддНТФ (ddNTP)] (див. Схему). Потім за допомогою ДНК-полімерази ведуть синтез другий (комплементарної) ланцюга ДНК. Зупинка синтезу (обрив ланцюга) відбуватиметься щоразу, коли замість дНТФ в зростаючу ланцюг ДНК буде вбудовуватися відповідний йому ддНТФ. На схемі принцип методу демонструється на прикладі з ддГТФ. У цьому випадку утворюються фрагменти, які включають праймер плюс 3, 6, 8, 13 або 14 інших нуклеотидів. Для визначення послідовності нуклеотидів необхідно поставити 4 окремі реакції в присутності кожного з чотирьох ддНТФ (в). Потім чотири проби вносять у сусідні лунки пластини гелю і проводять гель-електрофорез (г) (див. С. 84). Довжина пробігу кожного компонента обернено пропорційна довжині ланцюга.
Як тільки фрагменти ДНК візуалізовані (д), нуклеотидную послідовність можна прочитати прямо в гелі знизу в напрямку до старту у відповідність до черговості, в якій фрагменти розташовуються на окремих “доріжках” (е). Реальна електрофореграма з чотирма доріжками наведена на рис. 2. За оптимальних умов за допомогою методу обриву ланцюга можна в одному експерименті визначити будову фрагмента, що включає сотні нуклеотидів.
(1 votes, average: 5.00 out of 5)