Полімеразна ланцюгова реакція – конспект
Полімеразна ланцюгова реакція
Полімеразна ланцюгова реакція [ПЛР (PCR)] дозволяє багаторазово відтворювати (ампліфікувати) обраний фрагмент ДНК без допомоги рестриктаз, векторів або клітини-хазяїна (див. С. 254). Для цього потрібно мати у своєму розпорядженні два олигонуклеотида (праймера), кожен з яких буде гібрідізоваться з одного з ланцюгів на протилежних кінцях підлягає ампліфікації фрагмента ДНК, достатня кількість дезоксирибонуклеозидтрифосфатов і спеціальну термостабільну ДНК-полімеразу. Праймер синтезують, а полимеразу отримують з термостабільних бактерій.
На першій стадії двунітевой ДНК нагрівають до 90оС для розділення ланцюгів і отримання однонитевой ДНК (а). Потім суміш охолоджують, щоб відбулася гібридизація з праймерами (б). Комплементарні ланцюга ДНК синтезуються в обох напрямках, починаючи від праймерів (в). Цей циклічний процес (цикл 1) повторюють з тією ж самою реакційною сумішшю (цикл 2, 3 і т. д.) 20-30-кратно. Двунітевие фрагменти ДНК, рівні за довжиною відстані між двома праймерами, починають накопичуватися після третього циклу. Їх кількість подвоюється після кожного циклу до тих пір, поки майже всі синтезовані фрагменти не будуть відповідати первісним фрагменту, обмеженому праймерами. Цикли нагрівання та охолодження проводяться в термостаті-ампліфікаторі з програмованим температурним режимом.
Б. Аналіз довжини рестрикційних фрагментів
Рестріктази розщеплюють ДНК у специфічних ділянках, зазвичай в паліндромний послідовностях (див. С. 254). Коли одна з підстав в такій послідовності змінюється в результаті мутації, ця ділянка перестає розщеплюватися рестриктазами. У той же час мутації можуть призводити до утворення нових ділянок, чутливих до рестріктази. В результаті відповідні фрагменти ДНК, отриманої від двох генетично ідентичних індивідів, часто утворюють рестрикційні фрагменти різної довжини. Це явище носить назву поліморфізму довжин рестрикційних фрагментів ДНК (ПДРФ, англ. Restriction fragment length polimorphism, RFLP).
На рис. 1 наведено метод виявлення ПДРФ. Насамперед, ДНК-фрагмент, що містить досліджувану послідовність, амплифицируют за допомогою ПЛР (А). Потім ампліфікований фрагмент гидролизуют підходящої рестриктазой. Фрагменти розділяють гель-електрофорезом, що цікавить фрагмент виявляють за допомогою специфічного генного зонда (див. С. 256). На рис. 2 наведені результати застосування методу в криміналістиці. Рестрикционная карта зразка ДНК, виділеної з тканини, знайденої на місці злочину, чітко збігається з пробою, взятою у підозрюваного 2, а не у підозрюваного 1. Для отримання такого “генетичного відбитку” досить дуже малої кількості матеріалу, що містить ДНК. Другим важливим практичним додатком ПДРФ-аналізу є виявлення генетичних мутацій, що ведуть до спадкових захворювань.
В. надекспресія білків
Для лікування тих чи інших захворювань необхідні білки, наприклад білкові гормони, які у тварин присутні в малих кількостях і тому важкодоступні. В даний час такі білки можна отримувати у великих кількостях за допомогою надекспресія в бактеріальних або еукаріотичних клітинах. Для цього необхідно виділити відповідний ген з ДНК людини і клонувати його в складі плазміди. Крім цього гена плазмида повинна містити послідовність ДНК, яка робить можливою реплікацію і транскрипцію плазмідної ДНК в клітці-господаря. Як тільки відповідні клітини трансформовані плазмидой і станеться реплікація, транскрипція гена ініціюється шляхом індукції. Трансляція утворилася мРНК в клітині-хазяїні дозволяє виробляти необхідний білок в достатній кількості.
(2 votes, average: 4.00 out of 5)