Отримання генів

Гени для клонування можуть бути безпосередньо виділені з генома донорських клітин, отримані шляхом копіювання матричних РНК або за допомогою хіміко-ферментативного синтезу.

Для виділення гена, що несе певну функціональну інформацію, з донорської клітини можна використовувати різні методи (наприклад гідродинамічний дроблення або ультразвук). Однак основний інструмент вчених – рестріктірующіе ендонуклеази (рестріктази). Ці ферменти здатні впізнавати специфічні місця ДНК (сайти) і розщеплювати нуклеотидні послідовності в ДНК на фрагменти в цих строго певних ділянках. Біологічна роль рестриктаз, наприклад, в клітинах прокаріотів полягає в активному метілгідролізе чужорідної ДНК, проникаючої в клітини ззовні, власна хромосомная ДНК при цьому залишається незачепленою завдяки спеціальному механізму захисту. Перша рестріктаза була виділена в 1968 р, але вона не викликала інтересу і практично не застосовується. Через два роки були виділені більш активні ферменти цієї групи, які розщеплювали ДНК за специфічними послідовностям підстав з отриманням фрагментів. Це відкриття стало одним з основних у розвитку технології рекомбінантних ДНК, так як молекулярні біологи отримали засіб для розрізання ДНК точно в бажаних місцях і для ізолювання генів. В даний час відомо понад 500 рестриктаз і для багатьох з них визначені впізнавані послідовності. Значне число рестриктаз проводиться в якості кінцевих продуктів біотехнології, наприклад, такими компаніями як Sigma (США), Pharmacia (Швеція), Serva (Німеччина) та ін.

Фрагменти ДНК, отримані тим чи іншим методом, розділяють з допомогою електрофорезу в гелях, з яких їх екстрагують і проводять аналіз виділених і очищених фрагментів. З 160 мкг ДНК нематоди Caenorabiditis elegans вдається отримувати 2-4 мкг якого-небудь одного фрагмента.

Метод виділення генів має недоліки: набір рестриктаз, доступних на ринку, великий, але обмежений, тому часто важко підібрати рестріктази, що дозволяє вирізати точно задану ділянку, і фрагменти ДНК включають зайві нуклеотидні послідовності або в них не дістає частини нуклеотидноїпослідовності гена.

Додаткові складнощі виникають при використанні як донорів еукаріотних клітин (гриби, рослини, тварини та ін.), В яких гени, що кодують білок, мають мозаїчну структуру. У них чергуються Екзони – ділянки, що кодують білок, і інтрони – проміжні, некодуючі ділянки (терміни запропоновані У. Гілбертом в 1978 році). У клітці первинна РНК, синтезована на такий ДНК, піддається модифікації, в результаті якої ділянки, відповідні Інтрони вирізаються, а значущі ділянки зшиваються і утворюється зріла матрична РНК (мРНК), на якій синтезується білок (сплайсинг або процесинг мРНК). В процесі диференціювання еукаріотів виявлена??неоднотипних сплайсингу, а саме те, що в одному випадку постає Інтроном, в іншому може виявитися екзонах, і навпаки. Отже, існують гени, здатні кодувати не один білок.

Ці проблеми дозволяє вирішити ферментативний синтез генів на основі виділеної з клітки мРНК. Цей найбільш поширений метод отримання генів заснований на використанні зворотної транскрипції, що дозволяє отримати ДНК без інтронів та інших нетранскрібіруемих послідовностей безпосередньо на основі мРНК. Це явище було передбачене радянським генетиком С. М. Гершензон (роботи були розпочаті ще до війни, але, як і всі роботи з генетики в СРСР, перервані і поновилися лише на початку 60-х років). Спеціальний фермент – ревертаза каталізує синтез нитки ДНК, компліментарної мРНК. Отриману одноцепочечную нитка використовують для синтезу другої нитки ДНК за допомогою ДНК-полімерази або ревертази.

У 1979 році таким способом було отримано ген гормону росту чоловік (соматотропіну), пізніше – ряд інших генів.

Хіміко-ферментативний синтез індивідуального гена вперше був здійснений в роках в групі, що працює в США під керівництвом індійського хіміка Г. Корани. Метод включає хімічний синтез коротких (8-16 ланкових) одноцепочной фрагментів ДНК (олігонуклеотидів) за рахунок поетапного освіти ефірних зв’язків між нуклеотидами і зшивання нулеотідов (за допомогою лігаз, описаних нижче) з утворенням дволанцюжкових полинуклеотидов. Для цього необхідно мати повну інформацію про нуклеотидної послідовності гена. Послідовність нуклеотидів в гені може бути відтворена на основі первинної структури відповідного білка. Цим методом отримані гени соматостатина, інсулінів та ін.


1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars (1 votes, average: 5.00 out of 5)

Отримання генів