Моноклональні антитіла
У ссавців в ході еволюції виробився складний набір клітинних систем, що захищають організм від токсичних речовин та інфекційних агентів. Складовою частиною захисної реакції є индуцированная вироблення клітинами лімфатичної системи специфічних білків (антитіл), які з’єднуються з чужорідними речовинами (антигенами) і за допомогою інших білків імунної системи, включаючи системи комплементу, нейтралізують їх ефект. У відповідь на імунологічний стимул кожна антителопродуцирующих клітина синтезує і виділяє єдиний вид антитіл, які з високою спорідненістю розпізнають окрему ділянку (епітоп, антигенну детермінанту) молекули антигену. Оскільки в молекулі антигену зазвичай присутні кілька різних епітопів, антитіла проти кожного з них виробляються окремими клітинами імунної системи. Такі антитіла, кожне з яких взаємодіє з даним антигеном, називають поліклональними.
Вже на початку нинішнього століття, коли про поли клональності антитіл нічого не знали, було ясно, що їх специфічність можна використаний для придушення інфекцій. Пізніше антитіла стали застосовувати в якості діагностичного інструменту для виявлення токсичних сполук в клінічних зразках. На жаль, ефективність препаратів поліклональних антитіл варіює від однієї партії до іншої, оскільки в одних випадках при проведенні імунізації антителопродуцирующих клітини сильніше стимулюються одними детермінантами даного антигену, а в інших імунна система активніше відповідає на інші епітопи тозі ж антигену. Це може впливати на здатність різних препаратів нейтралізувати антигени, оскільки окремі епітопи володіють різною ефективністю (стимулюючої здатністю). Отже, в даній партії поліклональних антитіл може міститися мало молекул, спрямованих проти основного епітопів, і в результаті вона буде менш ефективною, ніж попередня.
Отже, для практичного застосування антитіл в якості діагностичного інструменту або компонентів терапевтичних засобів необхідно було створити таку лінію клітин, яка росла б в культурі і продукувала антитіла одного типу, що володіють високою спорідненістю до специфічного антигену-мішені, – моноклональні антитіла. Подібна клітинна лінія могла б стати невичерпним джерелом ідентичних молекул антитіл. На жаль, В-лімфоцити (В-клітини), які синтезують антитіла, не можуть відтворюватися в культурі. Рішення даної проблеми бачилося в створенні гібридної клітини. Отримавши генетичну складову від В-клітини, вона могла б виробляти антитіла, а придбавши здатність до поділу від клітини сумісного типу – рости в культурі. Було відомо, що В-лімфоцити іноді перероджуються і стають раковими (мієломна) клітинами, набуваючи здатність до зростання в культурі і зберігаючи в той же час багато властивостей В-клітин. Так клітини мієломи, в першу чергу ті, які не виробляють антитіл, стали кандидатами на злиття з антителопродуцирующих В-клітинами. У середині 70-х рр. ці ідеї стали реальністю.
Перший крок в процесі отримання гібридної клітинної лінії, яка продукує антитіла одного типу, полягає у введенні мишам антигену. Після низки імунізації, проведених протягом декількох тижнів, перевіряють, чи відбулося розвиток у тварин імунної відповіді. Якщо відповідь розвинувся, то тварин умертвляють, витягають селезінку, промивають її, подрібнюють і несильно струшують для вивільнення одиничних клітин, серед яких знаходяться і антителопродуцирующих В-клітини. Суспензія клітин селезінки змішують з суспензією мієломних клітин, дефектних за гипоксантин-гуанін-фосфорібозілтрансферази (HGPRT-). Комбіновану суспензія протягом декількох хвилин інкубують 35% – ному поліетиленгліколь, а потім переносять у середу, що містить гіпоксангін, аміноптерин і тимідин (середа ДАТ).
Обробка поліетиленгліколем полегшує злиття клітин, проте злиття відбувається рідко і є достатньою мірою випадковою подією. У суміші присутні клітини мієломи, селезінки, а також злилися клітини мієломи-селезінки, мієломи-мієломи, селезінки-селезінки. Однак у середовищі ДАТ ростуть тільки гібридні клітини мієломи-селезінки, всі інші типи клітин не можуть в ній проліферіровать. Клітини селезінки і злилися клітини селезінки-селезінки взагалі не ростуть в культурі, а мієломні клітини HGPRT – і злилися клітини мієломи-мієломи не можуть використовувати гипоксантин як попередника в процесі біосинтезу пуринових підстав гуаніну та аденіну, без яких неможливий синтез нуклеїнових кислот. Але у них є інший природний шлях синтезу пуринів – за участю дигідрофолатредуктази, тому до складу середовища і входить аміноптерин, що інгібує активність цього ферменту. Таким чином, мієломні клітини HGPRT – і злилися клітини мієломи-мієломи не можуть синтезувати пурини в середовищі ДАТ і гинуть.
Злилися клітини селезінки-мієломи ростуть в середовищі ДАТ, оскільки: 1) клітини селезінки поставляють функціональну HGPRT, яка може утилізувати екзогенний гипоксантин середовища незважаючи на блокування синтезу пуринів за участю дигідрофолатредуктази аміноптерин; 2) клітини мієломи здатні активно ділитися. Тимидин необхідний для усунення блокування в синтезі піримідинів, обумовленого інгібуванням дигідрофолатредуктази. На 10-14-у добу після злиття клітин в середовищі ДАТ залишаються і ростуть тільки злилися клітини селезінки-мієломи. Їх потім вносять в лунки пластикових мікротітровальних плашок і вирощують на повній культуральному середовищі без ДАТ.
Тепер необхідно ідентифікувати гібридні клітини, що виробляють антитіла до імунізують антигену. Для цього зазвичай проводять скринінг культуральних середовищ, що містять секретуються антитіла. Середу з тих лунок, в яких є зростаючі клітини, відбирають і переносять у лунки інший мікротитрувального плашки, попередньо покриті шаром молекул антигену-мішені. Якщо в культуральному середовищі знаходиться антитіло (перше антитіло), що розпізнає один з епітопів даного антигену, то воно зв’яжеться з антигеном і залишиться в лунках після їх промивання. Потім у лунки додають другий антитіло, специфічне до мишачим антитілам. Воно буде приєднуватися до будь-якого першого антитілу, пов’язаному з антигеном.
До використовуваному в імунній аналізі другого антитілу попередньо приєднують фермент, який перетворює незабарвлений субстрат в забарвлене з’єднання. Зміна кольору вмісту однієї з лунок говорить про те, що вихідна культуральная середу містила антитіло, специфічне до даного антигену. Якщо ж таке антитіло в середовищі відсутнє, то другий антитілу не буде з чим зв’язуватися і воно змиється при другому промиванні. Субстрат в таких ланках залишиться незабарвленим.
Лунки вихідної мікротитрувального плашки, середа з яких дає позитивний імунну відповідь (зміна кольору), можуть містити суміш злилися клітин. Щоб отримати лінії, що походять від однієї клітини (клони) клітинну суспензію з таких лунок розводять культуральної середовищем і висівають в інші лунки. Після культивування отриманих клонів середовища знову тестують, визначаючи, яка з клітинних ліній (гібридом) продукує моноклональні антитіла, що розпізнають антиген-мішень. У тому випадку, коли отримують більше однієї специфічною гібридоми, проводять подальші дослідження, що дозволяють визначити, чи спрямовані антитіла, що виробляються різними клонами, проти однієї і тієї ж антигенної детермінанти. Кожен клон, який продукує моноклональних антитіл, можна підтримувати в культурі практично нескінченно. Крім того, зразки можна заморозити в рідкому азоті і використовувати їх надалі як джерело клітин.
Застосування моноклональних антитіл дозволяє істотно підвищити специфічність методу ELISA, оскільки вони зв’язуються з одним, строго певним антигенним сайтом. До теперішнього часу отриманий цілий ряд моноклональних антитіл, які можна використовувати для виявлення різних сполук і патогенних мікроорганізмів. Альтернативою отриманню моноклональних антитіл з культури гібридомних клітин може бути відбір і виробництво моноклональних антитіл та їх частин (Fv-фрагментів), спрямованих проти антигену-мішені, за допомогою Е. coli.
(1 votes, average: 5.00 out of 5)