Мікробіологічний синтез полігідроксіалканоатів
Полігідроксіалканоати – це біодеградуємі полімери, синтезовані безліччю мікроорганізмів (насамперед Alcaligenes eutphus) і використовуються ними як внутрішньоклітинний джерело вуглецю та енергії. Вони мають різні властивості залежно від складу і можуть застосовуватися для отримання біодеградіруемих пластмас, які використовуються, наприклад, для виготовлення пакувального матеріалу. За оцінками, річний обсяг продажів біодеградіруемих пластмас становить приблизно 1,3 млрд. Доларів.
З усіх полігідроксіалканоатов найбільш повно вивчена і охарактеризована полі (3-гидроксимасляная кислота). Це відноситься як до самого полімеру, так і до кодований його синтез генам A. eutrophus. Полі (3-гідроксимасляної кислоту), її сополимер полі (3-гидроксибутират-со-3-гідроксівалерат) та іншої поліоксіалканоат, полі (3-гідроксівалеріановую кислоту), отримують у Великобританії в промисловому масштабі ферментацією за участю A. eutrophus.
Однак цей мікроорганізм зростає відносно повільно і використовує лише обмежене число джерел вуглецю, що робить виробництво досить дорогим. Можна використовувати інший шлях: при перенесенні генів біосинтезу цього полімеру в Е. coli виходять швидкозростаючі трансформанти, накопичують у великій кількості (до 95% сухої маси клітини) полі (3-гідроксимасляної кислоту). Полі (3-гидроксимасляная кислота) синтезується з ацетил-СоА в три стадії, каталізуються трьома різними ферментами. Оперон, що містить ці гени, був вбудований в плазміду у складі фрагмента довжиною 5,2 т. П. н., проте за відсутності селективного тиску, наприклад при зростанні в відсутність антибіотиків, приблизно половина клітин Е. coli втрачала дану плазміду вже після 50 генерацій. Це не дуже істотно, коли масштаби культивування малі, але стає серйозною проблемою при великомасштабної або безперервної ферментації. Щоб обійти ці труднощі, в плазміду, несучу оперон полі (3-гідроксимасляної кислоти), вбудували локус раrВ з іншої плазміди, який забезпечував стабілізацію плазмид, обумовлюючи загибель клітин, що не містять плазміди після сегрегації. Модифіковані плазміди залишалися стабільними навіть при конститутивний синтезі полі (3-гідрокси-масляної кислоти). Трансформантів Е. coli, що синтезують даний продукт, утворювали лише дуже невелика кількість ацетату, згубного для клітин, очевидно, внаслідок того, що весь надлишковий ацетил-СоА перетворювався на полі (3-гідроксимасляної кислоту), а не в ацетат. Ще одна перевага синтезу полі (3-гідроксимасляної кислоти) в Е. coli полягає в тому, що коли її екстрагують лужним розчином хлорноватістокіслого натрію (калію), то вона розкладається в меншій мірі, ніж при екстракції з A. eutrophus. Мабуть, це пов’язано з тим, що більша частина полімеру, синтезованого в Е. coli, знаходиться в кристалічному вигляді, в той час як в A. eutrophus – в аморфному. При цьому полімери, одержувані цими двома способами, ідентичні.
Полі (3-гидроксибутират-со-3-гідроксівалерат) аналогічний за своїми властивостями широко використовується поліпропілену, так що отримання його мікробіологічними методами може представляти комерційний інтерес. Однак штами Е. соli, в яких експресуються гени біосинтезу полімеру, синтезують тільки полі (3-гідроксимасляної кислоту), а не сополимер. Цю проблему можна вирішити, використовуючи для експресії клітини Е. coli, що несуть мутації в fadR і atoC. fadR відповідальний за негативну регуляцію біосинтезу жирних кислот, a atoC – за позитивну регуляцію їх поглинання. Роль локусу fadR в індукції біосинтезу сополимера неясна, але продукт гена аtоС впливає на синтез білків, що кодуються генами atoA і atoD і полегшують поглинання бактеріями пропионата з культуральної середовища. Останній перетворюється в пропіоніл-СоА і потім реагує з ацетил-СоА з утворенням 3- кетовалеріл-СоА, який у свою чергу може перетворюватися в 3-гідроксівалеріл-СоА, що включається в сополимер.
Висновок
Бактерії можна не тільки використовувати як “фабрики” для синтезу білків типу рестриктаз, а й отримувати з їх допомогою нові продукти, змінюючи метаболізм бактеріальних клітин введенням в них чужорідних генів або модифікацією вже існуючих. Можна створювати рекомбінантні мікроорганізми, здатні синтезувати самі різні низькомолекулярні з’єднання: L-аскорбінову кислоту, барвник індиго, амінокислоти, антибіотики, мономерні одиниці різних біополімерів. Загальна стратегія при цьому полягає у введенні в організм господаря-специфічних генів, клонованих у відповідному векторі, які кодують один або кілька ферментів, які каталізують не властиві мікроорганізму метаболічні реакції або впливають на здійснюваний ним у нормі біосинтез певних сполук. За наявними даними, створення нових метаболічних шляхів не є технічно нездійсненним. Цей підхід допоможе створити незвичайні, більш ефективні шляхи синтезу самих різних з’єднань.
(2 votes, average: 2.50 out of 5)