Методи визначення активності лактатдегідрогенази
Основний метод визначення активності ЛДГ – вимірювання оптичної щільності НАДН при довжині хвилі 340 нм. Вибір для практичних цілей реакції перетворення пірувату в лактат пояснюється тим, що внаслідок високого спорідненості ЛДГ до пирувату максимальна швидкість цієї реакції в три рази вище, ніж освіта пірувату з лактату. У випадку прямої реакції аналітичні труднощі пов’язані з підбором оптимальної концентрації пірувату, оскільки його висока концентрація в інкубаційному середовищі інгібує активність Н-субодиниці. Додавання до розчину пірувату іонів натрію і хлору дозволяє знизити інгібування ЛДГ субстратом.
Період преінкубаціі сироватки крові з субстратной сумішшю до додавання стартового реагенту (пірувату) необхідний для завершення реакцій, каталізуються іншими НАДН-залежними дегідрогеназ, присутніми в сироватці крові. Структурні аналоги лактату (α-оксибутират, α-оксікапронат) і бенкеті-вата (α-кетобутірат, глікоксілат) також можуть служити субстратом для ЛДГ.
Для визначення відносного вмісту ізоферментів ЛДГ використовують ряд фізико-хімічних методів. До них відносять ЕФ, іонообмінну хроматографію, иммунохимические методи, а також методи, в яких використовують відмінності кінетичних параметрів окремих ізоферментів і диференційовану чутливість їх до субстратів і інгібіторів. Метод ЕФ ізоферментів ЛДГ відносять до референсним.
Активність ЛДГ присутній в крові здорової людини незалежно від її статі і віку. Загальна активність ЛДГ в сироватці крові здорових осіб, визначена при 25 ° С, становить 100-225 МО / л. Методом ЕФ на будь підтримуючої середовищі в сироватці крові здорових осіб вдається розділити всі 5 ізоферментів ЛДГ, які у відсотковому відношенні розподілені наступним чином: ЛДГ1 – 14-26, ЛДГ2 – 29-39, ЛДГ3 – 20-26, ЛДГ4 – 8-16, ЛДГ5 – 6-16. Отримано і дещо інші варіанти розподілу ізоферментів ЛДГ в сироватці крові здорових осіб, проте у всіх спостереженнях процентний вміст ЛДГ2 в сироватці крові було вище, ніж ЛДГ1. При деяких методах ЕФ фракція ЛДГ5 може бути і не виявлена, частка її становить 0-6%.
Стабільність активності ЛДГ залежить від температури зберігання та складу середовища. Загальна активність ЛДГ знижується на 10% через добу зберігання при 4 ° С. При зберіганні різні зразки сироватки значно різняться за рівнем зміни загальної активності ЛДГ і співвідношенню її ізоферментів. Є дані, що зберігання проб замороженими призводить до значних змін у розподілі ізоферментів – зменшення частки слабоподвіжние изоферментов і збільшенню швидких фракцій, що може бути причиною помилкового збільшення відносини ЛДГ1 / ЛДГ2. ЛДГ1 і ЛДГ2 зберігали активність незмінною протягом 10 днів при зберіганні як при 4 ° С, так і при -20 ° С або 20 ° С. Активність ЛДГ4 знижується на 50% через 48 год зберігання при 4 ° С. У цих же умовах активність ЛДГ5 виявилася зниженою на 72%. Подальше нагрівання сироваток і крові, що зберігаються в холодильнику, до 37 ° С не повертає активність ЛДГ до вихідного рівня. Для запобігання помилок рекомендують визначати активність ЛДГ і співвідношення її фракцій у день взяття крові, а якщо такої можливості немає, зберігати сироватку протягом 24 годин при кімнатній температурі.
(2 votes, average: 5.00 out of 5)