Методи визначення активності креатинкінази
Фермент КК каталізує оборотне фосфорилування креатину і АДФ згідно реакції:
Аналітичні методи, використовувані в клінічній біохімії для визначення активності КК, можуть бути засновані як на прямій, так і на зворотної реакції. В ході реакції можна визначити кількість креатину або концентрацію креатинфосфату. Першими методами визначення активності КК були методи кінцевої точки; в даний час домінують кінетичні методи.
Креатинфосфат в кислому середовищі гідролізується з більшою швидкістю, ніж АДФ і АМФ, при цьому утворюються креатин і ортофосфат. Далі кількість звільненого при гідролізі ортофосфата визначають по формуванню молібденового синього в реакції
Фиске-Суббароу (прямий метод). В інших реакціях звільнений при гідролізі креатин взаємодіє з нингидрином, диацетилу або α-нафтолом з формуванням флюорофоров. Флюоресценцію останніх вимірюють при специфічних довжинах хвиль випускання на флюоресцентної спектрофотометре.
В даний час для визначення активності КК використовують метод, запропонований Олівер і співавт., Який заснований на зворотної реакції – кінетичному визначенні утворюється в реакції креатинфосфату. Кінетична УФ-спектроскопія – референсний метод визначення активності КК відповідно до методу Олівер і співавт.
Збільшення абсорбції реакційній суміші при довжині хвилі 340 нм і кінетичному вимірі дозволяє визначити активність КК у великому інтервалі активності. Подальше вдосконалення методу стосується введення в реакцію АМФ для інгібування аденілаткінази і додавання N-ацетилцистеїну з метою захисту тіолових груп ферменту від окислення.
Методи дослідження ізоферментів КК зазвичай ділять на 5 категорій: ЕФ на різних підтримуючих середовищах, іонообмінна хроматографія, імуноінгібірування, іммунопреціпітація, радіоімунного методи.
Електрофоретичні методи ідентифікації ізоферментів КК надійні, хоча вимагають багато часу; їх відносять до напівкількісним. Чутливість колориметрического методу ідентифікації изоферментов після ЕФ-поділу дуже низька, тому для отримання точних результатів рекомендують застосування флюоресцентного методу, хоча лінійний діапазон його відносно вузький. Дифузія флюоресцентних смуг менше в ацетаті целюлози, ніж в агарозе, однак поділ изоферментов відбувається краще в агарозе.
Активність КК визначають у сироватці та плазмі крові (як антикоагулянту можна застосовувати тільки гепарин), у спинномозковій та амніотичної рідини.
У крові здорових людей активність КК становить 20-75 МО / л у жінок і 20-150 МО / л у чоловіків. Більш висока межа норми для чоловіків пов’язана з більшою масою м’язової тканини; збільшення маси тіла при ожирінні не супроводжується підвищенням активності КК. Дискримінаційний рівень, вище якого активність КК може свідчити про наявність інфаркту міокарда, становить 200 МО / л, хоча і не виключена наявність субендокардіального інфаркту при активності КК 160-180 МО / л. Сучасні методичні прийоми
Дозволяють отримувати лінійні результати активності КК від 3 до 1000 МО / л. Прийнято вважати, що активність КК-МВ, на 6% перевищує активність КК, свідчить про наявність інфаркту міокарда, менша частка ізоферменту КК-МВ – про поразку скелетних м’язів. Ця величина умовна і пов’язана з діагностикою інфаркту міокарда.
(2 votes, average: 5.00 out of 5)