Фракціонування клітинних структур
Розроблено ряд методик для дослідження ізольованих відділів клітини. Для того щоб виділити клітинні органели, досліджуваний зразок подрібнюють і потім гомогенізують в забуференной середовищі з використанням гомогенізатора Поттера-Елведжема (тефлоновий товкач, що обертається в скляному циліндрі). Це порівняно м’який метод, який особливо кращий для виділення лабільних молекул і ультраструктур. Інші методики руйнування клітин включають ферментативний лізис, що руйнує клітинні стінки, або механічне руйнування заморожених тканин (помелом або за допомогою обертових ножів; під великим тиском; осмотическим шоком; багаторазовим чергуванням заморожування і відтавання).
Для виділення інтактних органел важливо, щоб середовище, в якому проводиться гомогенізація, була ізотонічної, тобто осмотичнийтиск буфера повинно відповідати тиску всередині клітини. Якщо розчин гіпотонічен, органели будуть “вбирати” додаткову воду і лопнуть, а в гіпертонічних розчинах вони, навпаки, зморщуються.
Слідом за гомогенизацией слід фільтрування через марлю для видалення інтактних клітин і сполучних тканин. Власне фракціонування клітинних органел проводиться за допомогою диференціального центрифугування, тобто центрифугування при різних швидкостях обертання ротора. При цьому ступеневу збільшення відцентрової сили (яку прийнято виражати величиною, кратною нормальному прискоренню вільного падіння g = 9,81 м / с2, див. Сс. 202-203) призводить до послідовного осадження різних органел, тобто їх поділу відповідно до щільності і розміром.
Ядро седіментірует вже при прискоренні, достигаемом про допомогою настільних центрифуг. Декантірованіе супернатанта і ретельне повторне ресуспендування осаду дає фракцію, збагачену клітинними ядрами. Однак ця фракція все ще містить інші клітинні компоненти в якості домішок, наприклад фрагменти цитоскелету.
Частинки менших розмірів і менш щільні, ніж ядро, отримують при впливі на супернатант поступово збільшується прискорення. Ця операція проводиться на більш потужних центрифугах, таких, як високошвидкісні центрифуги з охолодженням і ультрацентрифуги. Порядок освітлення фракцій наступний: мітохондрії, потім мембранні пухирці (везикули) і рибосоми. Супернатант останнього центрифугування являє собою “цитозоль”, тобто розчинні компоненти клітини, що перейшли при гомогенізації тканини в буферний розчин.
Виділення клітинних органел зазвичай проводять при низьких температурах (0-5 ° С) для того, щоб зменшити ступінь деградації матеріалу за рахунок реакцій, що каталізуються ферментами; останні вивільняються в процесі руйнування тканини. Додавання тиолов і хелатирующих агентів необхідно для захисту функціональних SH-груп від окислення.
Б. Молекули-маркери
У процесі фракціонування важливо контролювати чистоту фракцій. Присутність в певної фракції тієї чи іншої органели і наявність інших компонентів визначають за допомогою молекул-маркерів. Зазвичай це органеллоспеціфічние ферменти (ферменти-маркери). Розподіл ферментів-маркерів у клітці відображає локалізацію в ній відповідних каталітичних реакцій. Більш детально ці питання обговорюються в розділах, присвячених окремим органеллам.
(1 votes, average: 5.00 out of 5)