ДНК-діагностика людини

Останнім часом практична медицина збагатилася значним числом молекулярно-генетичних діагностичних методів, що пов’язують із здійсненням проекту “Геном людини” – геномні (постгенеомние) технології. Інтерес до методів молекулярно-генетичного аналізу людей (ДНК-діагностика) стимулюється усвідомленням того, що неодмінна умова підвищення ефективності профілактичних, превентивних і терапевтичних медичних (здравоохраненческіх) заходів – інформація про генетичну конституції окремих осіб (див. Передмову: геномні тестування або портретування) і про особливості гено (аллель) фондів людських популяцій чи інших груп населення. Цим значною мірою пояснюється “бум” в області біомедичних досліджень, спрямованих на пошук діагностичних і прогностичних маркерів (у тому числі генетичних) поширених і “грізних” патологічних станів, зокрема онкологічних.

Не можна забувати про такі генетичних явищах, як генокопіро-вання і фенокопірованіе, неповна експресивність і пенетрант-ність, генетична гетерогенність (див. П. 4.3.1.1), що ускладнюють діагностику багатьох спадкових хвороб. Наприклад, моногенне спадкове захворювання “муковісцидоз” (кістозний фіброз підшлункової залози), за поширеністю займає перше місце в групі аутосомно-рецесивних хвороб людини, обумовлено мутаціями в різних частинах гена, картировать на довгому плечі хромосоми 7 (7q31.2). У 50-70% пацієнтів мутація представлена ​​делецией трьох нуклеотидів в 10-му екзоні гена – delF508. Фенотіпіче-ський ефект мутації полягає у відсутності в кодируемом поліпептиді (всього 1480 амінокислот) в 508-му положенні амінокислоти фенілу-Ланина. Названий поліпептид бере участь у забезпеченні функції хлор-натрієвого чрезмембранного транспортного каналу в залізистих екзокринних клітинах. До теперішнього часу відомо близько 600 (за іншими джерелами, 800) мутацій гена, що призводять до муковисцидозу (частина пацієнтів несе одночасно дві мутації – генетичні компаунди). З кількох сотень мутацій клінічний інтерес представляють близько шести, так як саме вони є причиною розвитку патологічного фенотипу (тобто захворювання) у 70% пацієнтів. При синтезі залозистими клітинами бронхів, підшлункової залози і епітеліальної вистилки кишечника, слизової оболонки придаткових пазух носа та інших органів мутантного поліпептиду підвищується в’язкість утвореного ними слизового секрету. Це призводить до закупорювання шляхів відтоку слизу і розвитку запалення. Діагноз може бути поставлений на підставі клінічної картини, в якій поєднуються симптоми ураження бронхолегеневого апарату, кишкові розлади, ознаки дисфункції підшлункової залози, а також на підставі даних лабораторних досліджень, зокрема, якщо в поті виявляється ненормально висока (понад 60 ммоль / л) концентрація хлоридів. Встановлено певна залежність тяжкості захворювання від типу мутації, яка його викликала. Зараз методами ДНК-діагностики тип мутації, що призводить до муковисцидозу, визначається з надійністю в 72%, тобто діагностична ефективність (інформативність) не досягає бажаних 100%. Імовірно, одна з причин полягає в численності мутацій гена, що призводять до відповідного патологічного фенотипу (тобто до хвороби). Показники ефективності ДНК-діагностики різні для різних захворювань. У разі Ахонена-дроплазіі і хореї Гентінгтона, наприклад, вони досягають 100%, тоді як у випадку міодистрофії Дюшена – 60%.

Розрізняють прямі і непрямі методи ДНК-діагностики. Перші застосовуються, якщо відомі: ген, відповідальний за розвиток відповідного спадкового захворювання, основні типи його патологічних (патогенних) мутацій – у разі муковісцидозу найбільш часта (мажорна) мутація – delF508 (див. Тут же, вище).

В даний час пріоритетна роль в якості основи ДНК-діагностики переходить до методу ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція), або PCR (англ. Polymerase Chain Reaction). Названий метод дає можливість в умовах in vitro протягом 1 год отримати мільйони копій заданого (що представляє інтерес для дослідника або лікаря) фрагмента молекули (нуклеотидноїпослідовності) ДНК, використання яких завдяки їх численності істотно полегшує ідентифікацію в геномі пацієнта (пробанда) сайту ДНК, що представляє діагностичний інтерес. Популярність методу ПЛР в медичному середовищі пояснюється також тим, що він широко використовується в цілях високоточної і надійної діагностики вірусних (СНІД, вірусні гепатити) та інфекційних захворювань з виявлення нуклеїнової кислоти збудника.

Альтернативним методом ПЛР, поступається йому позиції в якості основи ДНК-діагностики, є метод блот-гібридизації (від англ. Blot – пляма, клякса; blotting paper – промокашка, фільтрувальна папір). В арсеналі молекулярних і медичних генетиків цей метод з’явився раніше методу ПЛР. Технічно він більш складний, вимагає використання радіоактивних матеріалів. В даний час його модифікації застосовуються для вирішення ряду конкретних завдань – гібридизація ДНК-зондів з розділеними за допомогою електрофорезу молекулами РНК, а також з білковими молекулами, фіксуються на фільтрах з міченими антитілами.

Непрямі методи ДНК-діагностики спадкових (насамперед, моногенних) хвороб (в загальному вигляді молекулярно-генетичні методи генетичного аналізу людей – див. Тут же, вище) засновані на ідентифікація не патологічних (патогенних) мутацій генів безпосередньо, а на аналізі наявності в геномі та поведінки (розподіл алелей генетичного маркера в геномах родичів: у сибсов, в парах “дед-онук”, “дядько-племінник”) в сім’ї обстежуваного так званих поліморфних генетичних маркерів – ділянок (ло-шматків) ДНК, тісно зчеплених у відповідному районі конкретної хромосоми з локусом, відповідальним за генетичне захворювання. На даний момент на хромосомах людини картіровано порядку 6 тис. Таких ДНК-маркерів (поліморфних генних локусів). Для деяких з них доведена асоціація з конкретним спадковим або мульти-факторним захворюванням. Так, аллель В27 генетичної системи HLA асоційований з “анкілозивний спондиліт” і “псоріатичним спондилітом”, аллель DR3 названої системи – з хворобою Аддісона і з розсіяним склерозом, аллель DR4 – з ревматоїдним артритом, аллель CW6 – з псоріазом.

Застосування непрямих методів ДНК-діагностики можливо при відсутності повної інформації про “проблемному” гені (він не ідентифікований і тому не відомий порядок проходження в ньому нуклеотиднихпослідовностей, тобто ген НЕ секвенирован). Необхідно, однак, знати, на якій хромосомі цей ген розташований.


1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars (1 votes, average: 5.00 out of 5)

ДНК-діагностика людини